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100T TSAPLUS FLUORESCESCE Triple tinción Kit Tiramida Amplificación de señal de inmunofluorescencia Reactivo

Especificación: 100t
Estado de Disponibilidad:
  • G1236-100t
  • Servicebio

Descripción del producto

Kit de tinción triple de fluorescencia de Tsaplus

Gato No. G1236-100T

Contenidos del paquete:

Número de artículo del producto

nombre del producto

Especificación

Kit de tinción triple de fluorescencia de Tsaplus

G1236-50t

50t

Kit de tinción triple de fluorescencia de Tsaplus

G1236-100t

100T

Introducción del producto:

Este producto TSAPLUS fluorescente El kit de tinción triple es adecuado para la múltipla de inmunofluorescencia múltiples múltiples secciones de parafina, especialmente para múltiples inmunolabelas fluorescentes de anticuerpos primarios de la misma fuente, y también para múltiples inmunolabelas fluorescentes de anticuerpos de diferentes fuentes. El principio principal se basa en la amplificación de señal de Tyramide (Amplificación de la señal TSA, TYRAMIDE), en lo sucesivo denominada tecnología TSA. El principio principal de la tecnología TSA es usar la reacción de la peroxidasa de la tiramida (es decir, la sal de tiramida marcada con fluorescencia forma un sitio de unión de enlaces covalentes en HRP catalizada por H2O2) para producir un gran número de reacciones enzimáticas. Este producto puede interactuar con los residuos de proteínas circundantes (incluidos los residuos de triptófano, histidina y tirosina), se combinan para formar una gran cantidad de deposición de fluoresceina en el sitio de unión a antígeno-anticuerpo para lograr la amplificación de la señal. Este kit utiliza tintes fluorescentes 488/555/647 para etiquetar a tiramina. La tiramina fluorescente resultante tiene una fuerte fluorescencia y una señal estable, que se puede usar para múltiples inmunolabelas repetidas para lograr múltiples tinciones fluorescentes.

Los datos del espectro de fluorescencia de los tintes fluorescentes relevantes de los kits de tinción fluorescentes de la serie TSA son los siguientes:

Tipo de tinte fluorescente

Ex / em

FITC-Tyramide

492/518

Cy3-tiramida

555/569

IF488-Tiramida

491/516

IF555-Tiramida

557/570

IF647-Tiramida

656/670

Condiciones de almacenaje:

Paquetes de hielo Transporte, tienda a -20 ° C, período válido es de 12 meses.

Composición

Número de componentes

Componente

G1236-50t

G1236-100t

Almacenamiento

G1236-1

IF488-Tiramida

25 μl

2 × 25 μl

-20 ℃

G1236-2

IF555-Tiramida

25 μl

2 × 25 μl

-20 ℃

G1236-3

IF647-Tiramida

25 μl

2 × 25 μl

-20 ℃

G1236-4

Diluyente tiramida

50 ml

50 ml

4 ℃

G1236-5

DAPI (listo para usar)

10 ml

20 ml

4 ℃

G1236-6

Autofluorescencia de tejido

10 ml

20 ml

Temperatura ambiente

G1236-7

Solución del tejido de autofluorescencia

10 ml

20 ml

Temperatura ambiente

G1236-8

Percher Anticluorescencia

5 ml

10 ml

-20 ℃

Preparación antes del experimento:

1. Prepare 0.01 mol / l PBS tampón (PH7.0-7.4, recomendado G4202 o G0002), 3% H2O2 y 0.3% H2O2;

2. Prepare el anticuerpo primario y el anticuerpo secundario marcado con el HRP correspondiente, la solución de recuperación de antígenos (elija la solución de recuperación de antígenos apropiada de acuerdo con el tipo de anticuerpo y tejido);

3. De acuerdo con la dosis, prepare la solución de trabajo de tinta de TSA de acuerdo con la siguiente proporción.

Solución de trabajo de tinción TSA

Artículo reactivo

Volumen

Solución de tinción TSA-488

Diluyente tiramida

1 ml

0.3% H2O2

10 μl

IF488-Tiramida

2 μl

Solución de tinción TSA-555

Diluyente tiramida

1 ml

0.3% H2O2

10 μl

IF555-Tiramida

2 μl

Solución de tinción TSA-647

Diluyente tiramida

1 ml

0.3% H2O2

10 μl

IF647-Tiramida

2 μl

NOTA: Después de que la tiramida fluorescente se funde, centrifuíala por un corto tiempo, y luego tómela después de mezclar con consejos de pipetija limpia. Se recomienda preparar una solución de trabajo de tio TSA para su uso inmediato. Debe almacenarse a 4 ° C y se debe proteger de la luz, y es efectivo dentro de las 24 horas.

Pasos

Tomar diapositivas de tejido como ejemplo, el agua en los siguientes pasos experimentales es el agua pura.

1. Depadofiniza las secciones de tejido al agua;

2. Recuperación de antígeno: de acuerdo con el anticuerpo primario utilizado y el tipo de muestra, use un método apropiado para realizar la recuperación de antígenos en la sección de tejidos.

3. Lave 3 veces con PBS, 5 minutos cada vez, use una pluma de Papanicolaou para rodear y marque el tejido;

4. Agregue 100 μl de Autofluorescence de la autofluorescencia Una solución gota a gota al tejido, incube a temperatura ambiente durante 30 minutos y se lava durante 5 min;

5. Inactivar la peroxidasa endógena: agregue un 3% de H2O2 a la sección para cubrir el tejido, e incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 25 minutos, para bloquear la peroxidasa endógena para reducir la tinción de fondo no específica. Lave 3 veces con 1 × PBS, 5 min cada vez;

6. Bloque: después de que las diapositivas se secan ligeramente, se agrega gota a gota BSA del 3% o suero para sellar durante 30 minutos. El reactivo de bloqueo se determina de acuerdo con las especies del anticuerpo primario y el anticuerpo secundario;

7. Incubar el anticuerpo primario: diluir el anticuerpo primario a una concentración apropiada con 1 × PBS o solución de bloqueo (G2010). Sacude suavemente la solución de bloqueo en la sección, agregue el anticuerpo primario diluido gota a gota para cubrir el tejido, y coloque la sección plana en una caja de cámara húmeda con agua e incube durante la noche a 4 ° C. Lave 3 veces con 1 × PBS, 5 min cada vez;

8. Incubar el anticuerpo secundario marcado con HRP: diluir el anticuerpo secundario a una concentración apropiada con 1 × PBS o solución de bloqueo (se recomienda G2010), agregue el anticuerpo secundario gota a gota al tejido, y incube a temperatura ambiente durante 50 min. Lave 3 veces con 1 × PBS, 5 min cada vez;

9. Agregue una solución de trabajo de tinta TSA-488 de 50-100μL de tsA-488 al tejido para asegurarse de que el tejido esté completamente cubierto, y se incube durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Lave con 1 × PBS 3 veces, 5 min cada vez;

10. Tratamiento de microondas: la sección de tejido se coloca en una caja de reparación llena con solución de recuperación de antígenos (elija la solución de recuperación de antígeno apropiada de acuerdo con el tipo de tejido y el anticuerpo) para el tratamiento con calentamiento de microondas para eliminar los anticuerpos primarios y secundarios unidos. En este paso, es necesario prevenir los copos secos causados ​​por la evaporación excesiva de líquidos.

11. Repita el paso 7 para incubar el segundo anticuerpo primario: diluir el segundo anticuerpo (anticuerpo primario) que se analizará con PBS (u otro diluyente de anticuerpo) a una concentración adecuada. Sacude suavemente el líquido en la sección, agregue el anticuerpo diluido gota a gota para cubrir el tejido, y coloque la sección plana en una caja humidificada con agua e incube durante la noche a 4 ° C. Lave con PBS 3 veces, 5 minutos cada vez;

12. Repita el paso 8 para incubar el anticuerpo secundario de HRP correspondiente: diluir el anticuerpo secundario a una concentración apropiada con PBS (u otro diluyente de anticuerpo), agregue el anticuerpo secundario gota a gota al tejido, e incube a temperatura ambiente durante 50 min. Lave con PBS 3 veces, 5 minutos cada vez;

13. Agregue una solución de trabajo de tinta de 50-100 μl de TSA-555 al tejido para garantizar que el tejido esté completamente cubierto, y se incube durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Lave con PBS 3 veces, 5 minutos cada vez;

14. Tratamiento de microondas: la sección de tejido se coloca en una caja de reparación llena con solución de recuperación de antígenos (elija la solución de recuperación de antígeno apropiada de acuerdo con el tipo de tejido y el anticuerpo) para el tratamiento con calentamiento de microondas para eliminar los anticuerpos primarios y secundarios unidos. En este paso, es necesario prevenir los copos secos causados ​​por la evaporación excesiva de líquidos.

15. Repita el paso 7 para incubar el segundo anticuerpo primario: diluir el segundo anticuerpo (anticuerpo primario) que se analizará con PBS (u otro diluyente de anticuerpo) a una concentración apropiada. Sacude suavemente el líquido en la sección, agregue el anticuerpo diluido gota a gota para cubrir el tejido, y coloque la sección plana en una caja humidificada con agua e incube durante la noche a 4 ° C. Lave con PBS 3 veces, 5 minutos cada vez;

16. Repita el paso 8 para incubar el anticuerpo secundario de HRP correspondiente: diluir el anticuerpo secundario a una concentración apropiada con PBS (u otro diluyente de anticuerpo), agregue el anticuerpo secundario gota a gota al tejido, y incube a temperatura ambiente durante 50 min. Lave con PBS 3 veces, 5 minutos cada vez;

17. Añadir 50-100 μl de TSA-647 tinción de la solución de trabajo al tejido para garantizar que el tejido esté completamente cubierto, y se incube durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Lave con PBS 3 veces, 5 minutos cada vez;

18. Núcleo contemporáneo con DAPI: después de que las secciones se secan ligeramente, agregue una solución de tinción DAPI al tejido, y incube durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Lave con PBS 3 veces, 5 min cada vez.

19. Ampliación de la autofluorescencia del tejido: agregue gota a gota a gota a gota la temperatura de la habitación, incube a temperatura ambiente durante 5 minutos y enjuague con agua corriente durante 3 min;

20. Montaje y examen microscópico: después de que las secciones se secan ligeramente, agregue el apagador anti-fluorescencia para montar las diapositivas. Observe y recoja imágenes con un microscopio de fluorescencia o un microscopio con láser confocal. Las rodajas se pueden almacenar durante 15 días a 4 ° C en una caja de diapositivas a prueba de luz.

Precauciones

1. En comparación con el anticuerpo secundario fluorescente, el kit TSA tiene una mayor sensibilidad y una señal más fuerte. Por lo tanto, la concentración del anticuerpo primario debe reducirse, generalmente en 5 a 10 veces en base a la relación de dilución recomendada en el manual de anticuerpos, para reducir la fluorescencia de fondo causada por una unión no específica. Se recomienda establecer la concentración de degradado del anticuerpo primario para obtener el mejor efecto.

2. Si la fluorescencia de fondo es fuerte, se recomienda agregar una etapa de apagado de autofluorescencia de tejido.

3. La relación de dilución recomendada de tiramida fluorescente es de 1: 500, y la relación de dilución se puede ajustar de acuerdo con los resultados experimentales (el rango de la relación de dilución recomendada es 1: 200-1: 1000).

4. Para un múltiple etiquetado fluorescente, se recomienda incubar primero el anticuerpo policlonal primero, luego incube el anticuerpo monoclonal; Incube el anticuerpo correspondiente a la proteína objetivo de baja abundancia primero, y luego incube el anticuerpo correspondiente a la proteína objetivo de gran abundancia.

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