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2 × Universal Blue Sybr Green QPCR Master Mix con 40 × Tampaje de dilución de plantillas amarillas

Estado de Disponibilidad:
  • G3326-01

Descripción del producto

Introducción del producto:

Este producto es una solución premix de 2x para QPCR utilizando el método de fluorescencia que se encuentra en Green I SYBR. El componente principal, la ADN polimerasa de TAQ, es un ADN polimerasa activado por calor bloqueado por el método de anticuerpos, que puede inhibir efectivamente la amplificación no específica en condiciones de baja temperatura. Mientras tanto, combinados con el tampón de reacción optimizado para QPCR, la ADN polimerasa TAQ es muy adecuada para una reacción de alta especificidad y sensibilidad QPCR. Se puede obtener una buena curva estándar en un área cuantitativa amplia, que es precisa, reproducible y confiable para el análisis cuantitativo de los genes objetivo. Al mismo tiempo, este producto contiene un tinte especial de referencia pasivo de ROX que es adecuado para su uso en todos los instrumentos QPCR, y no es necesario ajustar la concentración de ROX en diferentes instrumentos. Se agrega un tinte azul en la premezcla, que tiene el efecto trazador de agregar muestras, y se proporciona diluyente de plantilla amarilla al mismo tiempo. Cuando la plantilla se diluye con diluyente de plantilla amarilla y se agrega a la premezcla de reacción azul, el color cambia de azul a verde, que puede desempeñar un papel de trazador en la preparación del proceso del sistema de reacción y prevenir fugas o maldecir. Los espectros de los tintes azules y amarillos no se superponen con los tintes QPCR y no afectan los resultados de la reacción.

Contenidos del paquete:

Gato. No.

Descripción del Producto

Volumen

G3326-1

2x Universal Blue Sybr Green Green QPCR METT METR

1ml / 5x1ml / 15x1ml

G3326-2

Tampón de dilución de plantillas amarillas 40x

1ml

Condición de almacenamiento:

Transporte de bolsa de hielo mojada; Almacenado a -20 Temperatura, válida por 12 meses.

Uso:

1. (Opcional) Dilución de plantillas

Este kit proporciona un tampón de dilución de la plantilla amarilla de 40x, una dilución de plantilla amarilla diluida de 40 veces que se puede usar para determinar con precisión si se ha agregado la plantilla al fluido de reacción QPCR cambiando el color del líquido. Tomando el sistema de reacción de 20UL QPCR como ejemplo, de acuerdo con la cantidad de plantilla de dilución agregada en la solución de reacción de PCR de 20UL, se puede referir el método de dilución correspondiente de la plantilla original a la siguiente tabla (tomando la plantilla original diluida a 100ul como ejemplo. )

Agregue la plantilla diluida a la solución de reacción de 20UL QPCR (UL)

1

2

3

4

5

6

7

8

Agregue el búfer de dilución de plantilla amarilla 40x a laSistema de dilución de plantillas 100UL(ul)

50

25

16.7

12.5

10

8.4

7.2

6.3

Agregue el sistema de dilución de plantillas 100UL a la plantilla principal (UL)

x

x

x

x

x

x

x

x

Volumen de agregar agua sin nucleasa (ul)

50-x

75-x

83.3-x

87.5-x

90-x

91.6-x

92.8-x

93.7-x

Ejemplo: la plantilla diluida de 2UL debe agregarse al sistema de reacción de PCR de 20UL. Tomando el sistema de dilución de la plantilla de 100UL como ejemplo, cuando se agrega el volumen de la plantilla original de 20UL, se agrega la dilución de la plantilla amarilla de 40UL 40X, y luego se agrega agua de nucleasa libre de 5 años al volumen total de 100UL. El búfer de dilución de plantillas amarillas 40x es ahora 10x. Agregue 2UL de la plantilla diluida a un búfer de dilución de dilución de 20UL, y el tampón de dilución de plantilla de 40 × amarillo final es 1x. En conclusión, el tampón de dilución de la plantilla amarilla debe ser 1x en el sistema QPCR final.

NOTA: Si la plantilla no necesita ser diluida, o si no se usa el diluyente de plantilla de G3362-2, puede ignorar este paso.

2. Recomienda el sistema de reacción QPCR:

Componente

20UL RXN

50UL RXN

Concentración final

2 × Universal Blue Sybr Green QPCR Master Mix

10UL

25UL

1 ×

Primer delantero (10um) un

0.4UL

1UL

0.2um

Primer inversa (10um) a

0.4UL

1UL

0.2um

Plantilla

Variable

Variable

según sea necesario

Agua libre de nucleases

Añadir a 20UL

Añadir a 50ul


un. Por lo general, se puede obtener un buen efecto de amplificación con la concentración final de 0.2um. Cuando el rendimiento de la reacción es deficiente, la concentración de imprimación se puede ajustar en el rango de 0.2-1.0um.

B. La cantidad de adición de la plantilla varía con el número de copia del gen de destino en la solución de la plantilla, y la cantidad adecuada de la adición de la plantilla se discute mediante la dilución de gradiente. La mejor cantidad de adición de ADN de la plantilla en el sistema de reacción de 20UL fue inferior a 100 ng. Cuando se usó el ADNc (solución de reacción RT) de la reacción RT-PCR como plantilla, la cantidad de adición no debe exceder el 10% del volumen total de la solución de reacción de PCR.

3. Procedimiento de reacción de PCR (se puede ajustar de acuerdo con los instrumentos):

UN.Método de dos pasos

B. Método de tres pasos

Escenario

Paso

Número de ciclo

La temperatura

Time

Escenario

Paso

Número de ciclo

La temperatura

Time

Nivel 1

Predegeneración

1

95 ℃

30 segundos

Nivel 1

Predegeneración

1

95 ℃

30 segundos

Etapa 2

Degeneración

40

95 ℃

15 segundos

Etapa 2

Degeneración

40

95 ℃

15 segundos

Extensión de recocido

60 ℃

30segundo

recocido

55-65 ℃

10 segundos




extensión

72

30 segundos

Etapa 3

curva de fusión

1

Configuración predeterminada del instrumento

Etapa 3

curva de fusión

1

Configuración predeterminada del instrumento

A: Si la especificidad de la amplificación debe mejorarse, se puede usar el procedimiento de dos pasos o la temperatura de recocido; Para mejorar la eficiencia de amplificación, se puede usar un procedimiento de tres pasos o un tiempo de extensión.

Notas:

1. Si no se requiere rastreo de pipetos, no utilice un tampón de dilución de plantilla amarilla 40x para la dilución de la plantilla.

2. Antes de usar el reactivo, mezclarlo y bajar suavemente, no se arremolina y oscila para evitar las burbujas.

3. Al preparar la solución de reacción, coloque el reactivo sobre hielo.

4. Este producto contiene una tinción fluorescente SYBR GREEN, y se debe evitar la luz fuerte al preparar la solución de reacción de PCR.

5. Utilice una nueva punta de pipeta desechable para la preparación y reembolso del líquido de reacción para evitar la contaminación cruzada entre las muestras en la medida de lo posible.

6. Evite la mezcla maestra de congelación repetida, intente usarla dentro de un mes después de la descongelación.

Compatibilidad:

ABI: 5700, 7000, 7300, 7700, 7900, 7900HT, 7900 HT FAST, Stepone ™, Stepone Plus ™, 7500/7500 FAST, VIIA 7 ™, Serie Quantstudio ™, Pikorealtm Cycler;

Stratagene: MX3000P®, 3005P ™, 4000 ™;

BIO-RAD: CFX96 ™, CFX384 ™, ICYCLER IQ ™, IQ5 ™, MYIQ ™, Miniopticon ™, Opticon®, Opticon 2, Chromo4 ™;

EPPENDORF: REALPLEX 2S, MASTCYCLER® EP, REALPLEX;

IIIUMINA: ECO QPCR;

CEPHEID: SmartCycler®;

Qiagen Corbett: Serie ROTOR-GENE®;

Roche: Serie Lightcycler ™;

TAKARA: Serie Thermal Cycler Dice;

Analytikjena: serie qtower;

QTower: Serie Linegene.

Principios de diseño de imprimación:

1. Se recomienda la longitud del producto de amplificación entre 80-300 pb;

2. Longitud de la imprimación: 18-25 pb;

3. El contenido de la base G + C en los cebadores debe estar entre 40% -60%;

4. La diferencia de valor TM entre los cebadores hacia adelante y los cebadores inversos es menor que 2 ℃, y el valor TM entre 58-62 es el mejor;

5. aleatoriedad de la distribución de la base;

6. Los cebadores mejoraron que no contengan secuencias auto-complementarias, de lo contrario formarán una estructura de horquilla secundaria;

7. No debe haber más de 4 bases complementarias o homólogas entre dos cebadores, de lo contrario, se formará un dímero de imprimación, especialmente la superposición complementaria en el extremo 3 ';

8. La base terminal de 3 'de la imprimación se sugiere como G o C;

9. No se encontraron otros productos no específicos en los resultados de la comparación de NCBI.

Problemas y soluciones comunes:

Descripción del problema

Posibles razones

Soluciones

Al final de la reacción, apareció ninguna curva de amplificación o el valor CT apareció demasiado tarde

La concentración de la plantilla es demasiado baja.

Repita el experimento para reducir la dilución de la plantilla múltiple y comenzar desde la concentración más alta cuando se desconoce la concentración de la muestra

Degradación de la plantilla

La plantilla se preparó de nuevo y se repitió el experimento.


Hay inhibidores de la PCR en el sistema.

En general, la plantilla se lleva a cabo, la relación de dilución de la plantilla se incrementa o la plantilla con alta pureza se reprime y se repite.


Los cebadores pueden degradarse

Los cebadores que no se han utilizado durante mucho tiempo deben ser probados primero para su integridad por electroforesis para descartar la posibilidad de degradación


Baja eficiencia de amplificación

Ncrease la concentración de imprimación, pruebe un procedimiento de amplificación de tres pasos, o rediseñe el cebador


El producto de amplificación es demasiado largo.

La longitud del producto de amplificación se controló en el rango de 80-300 pb


El control en blanco muestra la señal.

Contaminación del sistema de reacción.

En primer lugar, el agua de control en blanco debe ser reemplazada. Si aún se produce la misma situación, se deben reemplazar los cebadores, aspiradores y tubos de PCR o se debe iniciar una nueva mezcla maestra. El sistema de reacción se prepara en una mesa súper limpia para reducir la contaminación de aerosol.

Aparece la amplificación no específica, como los dímeros imprimadores.

En general, es normal que los productos de amplificación aparezcan en el control en blanco después de 35 ciclos, que deben analizarse con la curva de fusión.

Redesign Primer, ajuste la concentración de imprimación u optimice el procedimiento de reacción de PCR


La curva de fusión tiene múltiples picos.

El diseño de imprimación es pobre.

El nuevo imprimador se re-diseñó de acuerdo con los principios de diseño de imprimación.

La concentración de imprimación es demasiado alta

Reducir adecuadamente la concentración de imprimación.


Hay contaminación genómica en la plantilla de ADNc.

La solución de ARN extraída se digiere utilizando enzimas de ADN, como DSDNase, para eliminar la contaminación genómica, o para diseñar cebadores de Transintron


Pobre reproducibilidad de experimentos.

El error de agregar muestra es grande.

El uso de pipeta precisa, con una pipeta precisa de la cabeza de succión de alta calidad;

Plantilla de alta dilución, agregando una plantilla de gran volumen para reducir el error de muestreo;

El volumen de reacción de QPCR se amplió.

La concentración de la plantilla es demasiado baja.

Repita el experimento para reducir los tiempos de dilución de la plantilla.


Desviación de temperatura en diferentes ubicaciones del instrumento QPCR

Calibrar el instrumento QPCR regularmente


La curva de amplificación no es suave.

La señal de fluorescencia es demasiado débil, producida después de la corrección del sistema.

Asegúrese de que los tintes premezclados en la mezcla maestra no se degradan;

Reemplace la señal fluorescente para recopilar mejores consumibles QPCR

Curva de amplificación se rompe o se desliza

La concentración de la plantilla fue mayor y el valor del punto final de referencia fue mayor que el valor de TC

El punto final de referencia (Value CT -3) se redujo y los datos se reanudaron

Curvas de amplificación de pozos individuales de repente cayeron bruscamente

Hay burbujas en el tubo de reacción.

Asegúrese de que la mezcla esté completamente disuelta, y no se arremolina y oscila uniformemente;

Una vez que se agrega la muestra, las burbujas se eliminan por centrifugación con luz elástica.

El tiempo de desnaturalización previo se extendió a 10 min para eliminar las burbujas.

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