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DNA Ligase 2 × In-Fusion Cloning Mix Molecular Biology Reactivo

Especificación: 100t
Estado de Disponibilidad:
  • G3350-100T
  • Servicebio
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Descripción del producto

G3350-100T

Introducción:

La mezcla de clonación de 2 × 2 × puede ligar y clonar rápidamente y clonar un solo o 2 ~ 3 fragmentos múltiples en el vector. Es especialmente adecuado para la ligadura de un solo fragmento, y se reducirá la eficiencia de 2-3 ligadura de fragmento. Use cualquier método para linealizar el vector, e introduzca la secuencia de extremo del vector linealizado a la 5 habla del cebador de amplificación hacia adelante / retroceso del fragmento de ADN insertado en el vector linealizado, de modo que los 3 'y 3' El producto de amplificación de PCR es respectivamente, existe una secuencia (15-25 pb) consistente con el extremo del vector linealizado. En la premezcla de mezcla de clonación de 2 × en fusión, mezcle el producto de PCR con la misma secuencia en ambos extremos del vector linealizado y el vector linealizado en una determinada proporción, y luego incube en hielo (o en una mezcla de hielo y agua) Durante 5 min, puede transformar las células competentes y la clonación direccional completa.

Esta premezcla puede lograr una clonación transparente de ADN eficiente y rápida. Y se puede utilizar para la construcción de plásmidos recombinantes o plásmidos recombinantes de mutación del punto genético. La premezcla no depende del sistema Ligase, reduciendo en gran medida el fondo de la auto-ligadura del vector y, al mismo tiempo, no necesita considerar los sitios de endonucleasa de restricción contenidos en el inserto en sí. Para la construcción de plásmidos recombinantes de ADN de un solo segmento, la proporción de clones positivos obtenidos utilizando esta premezcla es tan alta como el 99%. El uso de esta premezcla no se basa en el equipo de temperatura constante, y todas las operaciones de la preparación de la muestra de ADN a la transformación y la placa de productos recombinantes se pueden completar en unas pocas horas, lo que ahorra mucho tiempo.

Almacenamiento y transporte.

Transporte con hielo mojado; Almacenamiento a -20 ° C, válido por 12 meses.

Componente

G3350-10T

G3350-20T

G3350-100T

Mezcla de clonación de 2 × en fusión

50 μl

100 μl

5 × 100 μl

PUC19 (vector linealizado, control, 5 ng / μl)

-

10 μl

10 μl

Inserto de control (10 ng / μl)

-

10 μl

10 μl

Manual de usuario

1

Sistema de reacción (sistema de reacción recomendado de 10 μl)

Componente

Volumen

Mezcla de clonación de 2 × en fusión

5 μl

Vector

X μl

Segmento de ADN

Y μl

Agua libre de nucleases

Añadir a 10 μl

Condiciones de reacción

Baño de agua helado (mezcla de agua helada), reaccionar durante 5-10 min.


Conversión de producto de reacción

1. Retire las células competentes (como E.coli DH5α, E.coli Top10, etc.) del refrigerador a -80 ° C y descongele el hielo en hielo.

2. Agregue la muestra reaccionada al estado competente, mueva suavemente la parte inferior del tubo con los dedos para mezclarse, y bañarse en hielo durante 30 minutos.

3. El producto se coloca luego en un baño de agua de 42 ° C para calentar durante 90 segundos. Después de la finalización, se coloca rápidamente en hielo y se baña en hielo durante 2-5 minutos.

4. Tome 900 μl de medio SOC o LB estéril y agréguelo al tubo EP. Después de mezclar, coloque el tubo EP en una coctelera e incube a 220 rpm a 37 ° C durante 1 hora para recuperar las bacterias (también se puede colocar en una incubadora de 37 ° C para el cultivo de lugar estático durante 1 h);

5. De acuerdo con los requisitos experimentales, dibuje diferentes volúmenes de células competentes transformadas y agreguelos al medio sólido LB que contiene los antibióticos correspondientes, propague las células uniformemente, y después de que el líquido se absorba completamente, coloque la placa boca abajo en un 37 ° C Incubadora y cultiva durante la noche.

Identificación de clones positivos.

Las colonias monoclonales cultivadas en la placa se seleccionan para la identificación de la PCR de la colonia, o después de la cultura, el plásmido se extrae mediante la digestión de restricción o la identificación de la PCR, o el plásmido extraído se secuencial y se analiza directamente para la identificación.

Precauciones

1. El vector y el fragmento de destino deben purificarse por gel y electroforesis para detectar su calidad y concentración. Cuando la concentración es baja, no es necesario agregar agua y usarla directamente para compensar.

2. El valor TM entre las regiones superpuestas de múltiples fragmentos debe ser consistente y> 60 ° C.

3. Se recomienda que la relación molar de vector para insertar sea 1: 1 ~ 1: 3; Cuando se conectan 2-3 fragmentos, la relación molar entre cada fragmento es 1: 1, y la eficiencia de ligación de 2-3 fragmentos se reducirá. El sistema de reacción de ligación se puede ampliar en proporciones iguales. .

4. Cuando el volumen total del vector e inserto es mayor que 5 μl, el sistema de reacción se puede amplificar a 20 μl.

5. El volumen del producto de ligamiento no debe exceder el 1/10 del volumen de la célula competente, de lo contrario, la eficiencia de transformación se reducirá significativamente. El volumen del producto de ligación y la célula competente se pueden aumentar en la misma proporción (como 20 μl del sistema de ligación para transformar 200 μl de células competentes).

6. 2 × Se recomienda sacar la mezcla de clonación en la fusión cuando se use, y se devuelve a -20 ° C inmediatamente después de su uso. Después de descongelar, se puede dividir en paquetes y congelarse para reducir la congelación repetida y los tiempos de descongelación.

7. Cuando se utiliza la electroporación para la transformación, el producto de reacción debe ser purificado por método de columna o método de precipitación de etanol.

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