DNA Ligase 2 x Mezcla de ligadura universal con T4 DNA Ligase y tampón Biología molecular Reactivo

G3341-100

Descripción:

2 × Universal Ligation Mix es una premezcla de 2 × listos para usar que contiene T4 ADN Ligase y tampón de reacción. El ADN Ligasa de T4 contenidos puede catalizar el 5'-P y 3 hablas de extremos pegajosos o ADN de doble cadena de extremo contorno o ARN. Los extremos -OH se combinan con los enlaces de fosfodiéster. y puede reparar las mellas monocatenarias en cadenas de ADN, ARN y ADN de doble cadena. El tampón de reacción premezclado optimizado hace que la reacción sea más eficiente y conveniente de manejar. El sistema de reacción puede transformar una variedad de células químicamente competentes después de reaccionar a 25 ° C durante 5 minutos.

Almacenamiento y transporte.

Transporte con hielo mojado; Almacenamiento a -20 ° C, válido por 12 meses.

Sistema de conexión (Sistema de reacción recomendado de 10 μl)

Condiciones de reacción de ligación

La reacción de ligación del extremo pegajoso a 25 ° C es de 5 a 30 minutos, y la reacción de ligación del extremo romo a 25 ° C no excede las 2 horas o la reacción a 4 ° C durante la noche.

Conversión de productos de ligación.

1. Retire las células competentes (como E.coli DH5α, E.coli Top10, etc.) del refrigerador a -80 ° C y descongele el hielo;

2. Agregue la muestra reaccionada al estado competente, mueva suavemente la parte inferior del tubo con los dedos para mezclar bien, y el baño de hielo durante 30 minutos;

3. El producto se coloca luego en un baño de agua de 42 ° C durante 90 s para calentar el choque, y después de eso, se coloca rápidamente en hielo durante 2-5 min;

4. Tome 900 μl de medio SOC o LB estéril y agréguelo al tubo EP. Después de mezclar, coloque el tubo EP en una coctelera e incube a 220 rpm a 37 ° C durante 1 hora para recuperar las bacterias (también se puede colocar en una incubadora de 37 ° C para el cultivo de lugar estático durante 1 h);

5. De acuerdo con los requisitos experimentales, dibuje diferentes volúmenes de células competentes transformadas y agreguelos al medio sólido LB que contiene los antibióticos correspondientes, propague las células uniformemente, y después de que el líquido se absorba completamente, coloque la placa boca abajo en un 37 ° C Incubadora y cultiva durante la noche.

Identificación de clones positivos.

Las colonias monoclonales cultivadas en la placa se seleccionan para la identificación de la PCR de la colonia, o después de la cultura, el plásmido se extrae mediante la digestión de restricción o la identificación de la PCR, o el plásmido extraído se secuencial y se analiza directamente para la identificación.

Precauciones

1. Se recomienda configurar el sistema de reacción en el hielo.

2. Los fragmentos vectoriales y diana deben ser purificados por gel y electroforesis para detectar su calidad y concentración. Cuando la concentración es baja, puede usarlas directamente para compensar sin agregar agua. Cuando el volumen total del vector e inserto es mayor que 5 μl, el sistema de reacción se puede amplificar a 20 μl.

3. Se recomienda que la relación molar de vector para insertar sea 1: 3 ~ 1: 10.

4. Cuando se utiliza la electroporación para la transformación, el producto de ligación debe ser purificado por método de columna o método de precipitación de etanol.

5. 2 × Se recomienda sacar la mezcla de ligadura universal cuando se use, e inmediatamente regresó a -20 ° C después de su uso. Después de descongelar, se puede embalar y congelar para reducir la cantidad de ciclos de congelación repetidos.

6. Cuando conecte un vector de extremo contorno a un fragmento de ADN, el vector debe ser desfosforilado (G3400 recomendado) para evitar su autocirculación.

7. Por favor, use ropa de laboratorio y guantes desechables durante la operación.