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Kit de clonación de cero Pswe-Topo para la conexión de ADN Reactivo de biología molecular

Especificación: 25T
Estado de Disponibilidad:
  • G3022-25t
  • Servicebio
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Descripción del producto

G3022-25t

Introducción:

El kit de clonación de Pswe-Topo Zero producido por nuestra empresa es un vector para detectar recombinantes positivos de detección a través de la expresión de genes de suicidio y se modifica desde el vector PUC19. Cuando el fragmento de genes de destino no está conectado al vector, el gen suicida se expresa correctamente y se expresa correctamente, y las células que contienen el vector no pueden crecer; Cuando el fragmento del gen diana se conecta con éxito al vector, el gen del suicidio no se expresará correctamente, y las células que contengan el vector pueden crecer normalmente. Este vector también se llama vector de fondo \"cero \". Al mismo tiempo, el kit de clonación de Pswe-Topo Zero de nuestra compañía utiliza un nuevo método de ligadura de vectores, no se necesita ninguna ligasa adicional para conectar el fragmento al vector, solo se debe agregar el fragmento del gen diana al vector a temperatura ambiente (22 ℃ -37 ℃) La operación de conversión se puede realizar después de reaccionar durante 5 minutos. El kit de clonación CERO PSSWE-TOOPO es compatible con la clonación de TA y la clonación de extremo romo.

Características: Fácil de usar, compatible con la clonación de TA y la clonación de puntas romas; No se requiere una reacción de enzima adicional, se agrega el fragmento del gen diana al sistema, y ​​la transformación normal se puede realizar dentro de los 5 minutos a temperatura ambiente; La tasa positiva puede alcanzar el 95%; Fragmentos cortos y largos aplicables para la clonación; El marcador de selección es ampicilina; Primeros de secuenciación: cebador hacia adelante M13, cebador inversa M13.

Almacenamiento y transporte.

Transporte con hielo mojado; Almacenamiento a -20 ° C, válido por 12 meses.

Número de componentes

Componente

G3022-25t

G3022-1

Pswe-topo cero vector (50 ng / μl)

25 μl

G3022-2

Plantilla de control (700 pb, 50 ng / μl)

10 μl

G3022-3

Primer delantero M13 (10 μM)

50 μl

G3022-4

Primer inversa M13 (10 μM)

50 μl

Manual

1

Pasos

1. Preparación de productos de PCR.

(1) Los cebadores no pueden ser fosforilados; (2) la ADN polimerasa de alta fidelidad y TAQ se pueden usar para reacciones de PCR; (3) Se recomienda utilizar kits de recuperación de gel para la purificación de productos de PCR después de la electroforesis.

2. Sistema de reacción de referencia:

Componente

Volumen

Pswe-topo cero vector (50 ng / μl)

1 μl

Fragmento genético

0.5-4 μl

Dosis recomendada de inserto: la relación molar de vector al fragmento = 1: 10-1: 3. Puede calcularse aproximadamente agregando 50 ng de 1 kb fragmento. Si se construye la biblioteca de genes, el sistema de reacción se puede ampliar adecuadamente.

3. Mezcle suavemente el vector y los fragmentos de genes de acuerdo con el sistema de reacción de referencia anterior, reaccionan a temperatura ambiente (20-37 ° C) durante 5-10 minutos, y coloque el tubo de centrífuga en el hielo.

4. Transformación: a. Agregue 50-100 μl de clon competente (o agregue el producto de reacción a 50-100 μl de clon competente), mezcle suavemente y baño de hielo durante 30 min; B, transforme inmediatamente el choque térmico del sistema a 42 ° C durante 45 s, colóquelo inmediatamente sobre hielo durante 2-3 min; c, agregue 200 μl de medio SOC o LB equilibrado a temperatura ambiente en el sistema de transformación, e incube a 200 rpm y 37 ° C durante 1 h; D, tome 200 μl de propagación de la solución bacteriana en una placa resistente e invierta durante la noche a 37 ° C (para obtener más clones, puede eliminar parte del sobrenadante después de la centrifugación y propague la solución bacteriana en la placa resistente).

5. Detección de transformantes positivos:

un. Identificación de PCR de la colonia de clones positivos: seleccione un solo clon en 10 μl de agua estéril, vórtice para mezclar, luego tomar 1 μl de la mezcla como plantilla de PCR, y cebador de reenvío M13 y cebadores inversos M13 como cebadores universales para identificar clones positivos PCR de colonia. (Recomienda G3304 y G3305; Consulte el manual del producto correspondiente para el sistema y los procedimientos de reacción de PCR, y PCR fragmentos amplificados de clones positivos> 100 pb)

B. Identificación de clones positivos mediante la digestión de la enzima de restricción: seleccione un clon único y inóquelo en una cantidad apropiada de medio líquido resistente y lo cultive durante la noche a 220 rpm y 37 ° C. Se extrajo una pequeña cantidad de plásmido, digerida con enzimas de restricción apropiadas, y los clones positivos se identificaron mediante electroforesis en gel.

C. Secuenciación Para identificar clones positivos: use cebadores de primer plano M13 y cebadores inversos M13 para la secuenciación y el análisis.

Precauciones

1. Cuando utilice el producto, es recomendable almacenar el producto en una caja de hielo o en un baño de hielo, y almacenarlo a -20 ° C inmediatamente después de su uso.

2. Las cepas de E. coli DB3.1, la supervivencia de la CCDB, estable, JM109, XL1-BLUE y XL10-GOLD, estas cepas pueden tolerar la CCDB y se pueden usar para propagar o almacenar plásmidos que contienen CCDB, por lo que PSWE-TOOPO CERO vector es No aplicable al filtro. Las células competentes de Escherichia coli que no son tolerantes a la CCDB, como DH5α, TOP10, TG1, que se usan comúnmente en otros laboratorios, son aplicables.

3. Para su seguridad y salud, use abrigos de laboratorio y guantes desechables para la operación.

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