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Kit de detección de Brdu para detección de ADN 100T Proliferación celular Detección Reactivo

Volumen:100t

Estado de Disponibilidad:
  • G4102-100T
  • Servicebio

Descripción del producto

Información del Producto

nombre del producto

Gato. No.

Especificación

Kit de detección de Brdu

G4102-50T

50t

G4102-100T

100T

Introducción del producto:

Este producto BRDU Kit de detección se utiliza para la detección de la proliferación celular de las células y las secciones de tejido. Brdu (5-bromo-2-desoxiuridina), que es de 5-bromodeoxiuridina, es un análogo de timidina (T). El principio de este kit es que Brdu puede reemplazar la timidina T por la competencia. Ingrese la fase de síntesis de ADN (fase S). Cuando Brdu se incorpora a las células en la división vigorosa, las células que contienen BRDU se pueden detectar mediante el uso de anticuerpos anti-brdu y la ligasa de anticuerpo o fluoresceína como un sistema indicador, y se combina con otros marcadores de células para el etiquetado dual, la proliferación de células se puede juzgar Los tipos, la velocidad de proliferación, etc. son de gran importancia para el estudio de la dinámica celular. Brdu ingresa a las células de tejido a través de la inyección intravital o el cultivo celular, y el ADN incorporado en él se posiciona con precisión, lo que puede reflejar efectivamente el nivel de ADN recién sintetizado en las células S-Fase, y se ve menos afectado por el entorno interno y externo de la célula. , y la etiqueta no se perderá.

Almacenamiento y transporte.

Bolso de hielo (hielo húmedo) Transporte; Fluido de ruptura, el fluido de bloqueo (3% BSA), 1 M HCl se puede almacenar a 4 ° C, el paraformaldehído al 4% se puede almacenar a temperatura ambiente, anti-BRDU (MAP MAB) debe almacenarse a -20 ° C, caducidad Fecha 12 meses.

Componente

Número de componentes

Componente

G4102-50T

G4102-100T

G4102-1

Fluido de ruptura

30 ml

30 ml

G4102-2

Líquido de sellado (3% BSA)

30 ml

30 ml

G4102-3

4% paraformaldehyde

30 ml

30 ml

G4102-4

1 m hcl

30 ml

30 ml

G4102-5

Anti-Brdu (Mouse MAB)

50 μl

100 μl

Manual del usuario del producto

1 PC

1 PC

Preparación de experimentos

1. Traiga su propio búfer PBS (recomendado G4202), anticuerpo secundario, etanol degradado, tabletas de montaje, etc.;

2. Traiga su propia solución de tinción nuclear, recomiende la mancha de hematoxilina G1004 o la mancha DAPI G1012 (lista para usar);

3. Prepare la solución de trabajo de anticuerpos primarios anti-brdu: dilute anti-brdu (MAB de ratón) con solución de bloqueo (3% BSA) 100 veces para preparar la solución de trabajo de anticuerpos primaria anti-BRDU, prepare para su uso actual, almacene a 4 ℃;

4. Solución de trabajo de anticuerpos secundarios: prepare su propio HRP-etiquetado (detección de luz blanca posterior, kit de color DAB, recomendado G1212) o etiquetado con fluorescencia (detección de fluorescencia posterior) anticuerpo secundario anti-mouse, y diluya con PBS para preparar el fluido de trabajo de anticuerpos secundarios .

Pasos de operación:

Muestra de celda:

1. Preparación de células: prepare los diapositivos de celda por adelantado para garantizar que las células estén en condiciones normales y se adhieran bien;

2. Incubación de Brdu: las células se incuban con un medio que contiene Brdu en una incubadora en la oscuridad durante un cierto período de tiempo. La concentración de BRDU y el tiempo de incubación de las células son diferentes dependiendo del tipo de célula. Se recomienda explorar las mejores condiciones en el pre-experimento. Las condiciones experimentales de las células probadas en las precauciones son para referencia;

3. Fijación de células: las células mencionadas anteriormente se incubaron con Brdu y se lavaron 3 veces con PBS durante 5 minutos cada vez. Agregue 1 ml de paraformaldehído al 4% al orificio para cubrir las células y fijar durante 20-30 minutos a temperatura ambiente. Lave con PBS 3 veces, 5 minutos cada vez;

4. PERMABILIDAD: agregue líquido de ruptura al orificio para cubrir las celdas durante 8-10 minutos, lavar con PBS 3 veces, 5 minutos cada vez;

5. Tinción nuclear (opcional):

Para detección de luz blanca posterior, mancha el núcleo celular con hematoxilina: agregue solución de tinción de hematoxilina a la placa de pozo durante 5 minutos a temperatura ambiente, aspire la solución de tinción de hematoxilina y se lava 3 veces con PBS durante 5 minutos cada uno;

Para detección posterior de fluorescencia, mancha el núcleo celular con DAPI: agregue la solución DAPI DYE a la placa de pozo durante 5 minutos a temperatura ambiente, aspire la solución DAPI DYE, y lave 3 veces con PBS durante 5 minutos cada vez;

6. Reajustación: agregue 4% paraformaldehyde gota a gota a la placa de pozo e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente, lávelo 3 veces con PBS, 5 min cada vez;

7. Acidificación: agregue 1 M HCl gota a gota a la placa de pozo para cubrir las celdas, tratar a 37 ° C durante 10 minutos, lavar 3 veces con PBS, 5 min cada vez;

8. Post-fijación: agregue nuevamente para formaldehído al 4% a la placa de pozo, incube a temperatura ambiente durante 10 minutos, lavar con PBS 3 veces, 5 minutos cada vez;

9. Bloqueo: agregue la solución de bloqueo (3% BSA) gota a gota a la placa de pozo e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente. Absorbe y deseche la solución de bloqueo, no limpie;

10. Incubación de anticuerpos anti-BRDU: agregue gota a gota la solución de trabajos de anticuerpos primarios anti-brdu a la placa de pozo para cubrir las células e incubar durante la noche a 4 ° C. Aspire y deseche la solución de trabajo de anticuerpos primarios anti-brdu, lavar con PBS 3 veces, 5 min cada vez;

11. Incubación de anticuerpos secundarios: suelte la solución de trabajo de anticuerpos secundaria en la placa de pozo para cubrir las células y la incubación a temperatura ambiente durante 1 h. Aspire y deseche la solución de trabajo del anticuerpo secundario, y lave con PBS 3 veces, 5 min cada vez. Tenga en cuenta que si utiliza un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia, debe evitar la luz durante la incubación y el lavado;

12. Revestimiento y examen microscópico:

Si es un anticuerpo secundario marcado con HRP, use un reactivo cromogénico DAB (G1212 recomendado) para desarrollar el color de la muestra de la celda, la deshidratación y la transparencia. Use una pinzas puntiagudas para recoger suavemente la diapositiva y montarla boca abajo en un tobogán de vidrio limpio. , Observación de microscopio;

Si es un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia, cae un montaje de apagado antifloorcencia (se recomienda G1401) en el deslizamiento de vidrio limpio, levante suavemente la diapositiva con pinzas puntiagudas, la hebilla boca abajo en el deslizamiento de vidrio y monte la diapositiva. un microscopio de fluorescencia;

Muestras de la sección de tejidos:

1. Preparación de animales: prepare a los animales experimentales por adelantado y realice el etiquetado de Brdu in vivo, consulte la WGB8010. Después de etiquetar in vivo, tomar materiales, arreglar y preparar las secciones de parafina de acuerdo con las necesidades experimentales;

2. Las secciones de parafina de tejido están deparafinizadas y rehidratadas;

3. Reparación: Agrupe el cepillo para rodear el tejido, sumerja la rebanada en la solución de recuperación de antígenos y reparación por calentamiento de microondas. Refrigeración natural

4. Tinción nuclear (opcional):

Para detección de luz blanca posterior, mancha el núcleo celular con hematoxilina: agregue solución de tinción de hematoxilina a la placa de pozo durante 5 minutos a temperatura ambiente, aspire la solución de tinción de hematoxilina y se lava 3 veces con PBS durante 5 minutos cada uno;

Para detección posterior de fluorescencia, mancha el núcleo celular con DAPI: agregue la solución DAPI DYE a la placa de pozo durante 5 minutos a temperatura ambiente, aspire la solución DAPI DYE, y lave 3 veces con PBS durante 5 minutos cada vez;

5. Re-fijación: agregue 4% paraformaldehyde gota a gota al tejido e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente, lávelo 3 veces con PBS, 5 min cada vez;

6. Acidificación: agregue 1 M HCl a las rodajas para cubrir los tejidos, tratarlos a 37 ° C durante 10 minutos, lavarlos con PBS 3 veces, 5 min cada vez;

7. Post-fijación: agregue un 4% paraformaldehyde gota a gota a la placa de pila nuevamente e incube durante 10 minutos, lavar con PBS 3 veces, 5 min cada vez;

8. Acabado de peroxidasa endógena (opcional): agregue un 3% de H2O2 gota a gota a las rodajas e incube a temperatura ambiente durante 25-30 minutos para eliminar la peroxidasa endógena. Luego, las rodajas se lavaron 3 veces con PBS, 5 min cada vez;

9. Bloqueo: agregue una solución de bloqueo (3% BSA) a las rodajas para cubrir el tejido, y la incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos. Retire el fluido de bloqueo, no limpie;

10. Incubación de anticuerpos anti-BRDU: agregue la solución de trabajo de anticuerpos primarios anti-brdu a las rodajas para cubrir el tejido, e incubar durante la noche a 4 ° C. Retire la solución de trabajo de anticuerpos primaria anti-brdu, lávelo 3 veces con PBS, 5 min cada vez;

11. Incubación de anticuerpos secundarios: agregue la solución de trabajo del anticuerpo secundario a la sección para cubrir el tejido, y la incubación a temperatura ambiente durante 1 h. Retire la solución de trabajo del anticuerpo secundario, Lave 3 veces con PBS, 5 min cada vez. Tenga en cuenta que si utiliza un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia, debe evitar la luz durante la incubación y el lavado;

12. Revestimiento y examen microscópico:

Si es anticuerpo secundario marcado con HRP, use un reactivo cromogénico DAB (G1212 recomendado) para desarrollar el color de la sección de tejido, deshidratar, transparente y observar bajo el microscopio después del montaje;

Si es un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia, agregue tabletas de montaje de anti-fluorescencia a gota (G1401 recomendadas) para montar y observar con un microscopio de fluorescencia.

Observación de resultados

Si se detecta con anticuerpo secundario marcado con HRP, el núcleo es azul oscuro, y las células proliferantes son marrones. Si es un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia, el núcleo mostrará la fluorescencia azul (EX = 358 NM, EM = 461 NM), y las células de proliferación mostrarán la fluorescencia del anticuerpo secundario correspondiente.

Notas:

1. Para muestras de deslizamiento celular, la concentración y el tiempo de procesamiento de BRDU están relacionados con los tipos de células. En términos generales, la concentración y el tiempo requerido para tratar las células tumorales son bajas. Las células con proliferación lenta, como los fibroblastos o las células epiteliales, deben aumentar la concentración y prolongar el tiempo de acción. El rango de concentración recomendado es de 20-100 μm y el tiempo de acción es de 40 min. -4 horas, se pueden ajustar de acuerdo con los tipos de células específicas.

La siguiente tabla muestra la concentración de tratamiento celular comúnmente usada y el tiempo probado, solo para referencia.

Celda

Concentración de brdu (μm)

Tiempo de incubación (min)

A549

40

40

Hela

40

40

NRK-52E

40

40

SKOV3

80

120

H9c2

40

40

2. Para garantizar los mejores resultados experimentales, se recomienda utilizar otros reactivos de soporte producidos por nuestra empresa: mancha de hematoxilina (G1004); Mancha DAPI (G1012); Kit de reactivo de color DAB (G1212), tabletas de montaje antifloorcencia (G1401);

3. Para su seguridad y salud, use abrigos de laboratorio y guantes desechables para la operación.

¡El producto es solo para fines de investigación científica, no para el diagnóstico clínico!

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