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Kit de detección de apoptosis de células PI de la anexina V-if647 / PI

Volumen: 50t
Estado de Disponibilidad:
  • G1514-50t
  • Servicebio
  • Servicebio

Descripción del producto

Información del Producto:

Nombre del producto

Gato. No.

Volumen

Kit de detección de apoptosis de células PI de la anexina V-if647 / PI

G1514-50t

50t

G1514-100t

100T

Descripción del Producto:

La apoptosis es un proceso fisiológico normal que ocurre en el proceso de desarrollo embrionario y mantenimiento de la homeostasis tisular. Está acompañado de muchos cambios morfológicos. Entre ellos, la pérdida de la membrana celular es una de las características tempranas de la apoptosis. En las células normales, la fosfotidilserina (PS) solo se distribuye en el lado interior de la bicapa fosfolípida de la membrana celular, pero en la etapa temprana de la apoptosis, PS se altará del lado interno de la membrana lipídica al lado exterior, exponiéndolo al exterior de la celda. La anexina V (anexina V) es una proteína de unión a fosfolípidos más dependientes de CA2 + con alta afinidad por PS y se une específicamente a las células expuestas a Ps. Por lo tanto, la anexina V se utiliza como uno de los indicadores para detectar la apoptosis de células tempranas. El yoduro de propidio (PI) es un tinte de ácido nucleico. No puede penetrar en las células normales con membranas celulares intactas y células apoptóticas tempranas, pero pueden penetrar en las membranas celulares de las células apoptóticas y necróticas tardías y manchan el núcleo.

Este producto utiliza la anexina V IF647 fluorescente tinte etiquetada como una sonda de detección para detectar la apoptosis de células tempranas. Al mismo tiempo, PI se usa para distinguir las células sobrevivientes de células apoptóticas necróticas y tardías. El uso combinado de la anexina V-if647 y la PI, las células vivas muestran una tinción negativa (anexina V- / pi-), las células apoptóticas tempranas muestran positivos de fluorescencia única (anexina V + / pii), y células apoptóticas tardías y células necróticas muestran positivo de fluorescencia dual. (Anexoin V + / PI +). Este kit es adecuado para la citometría de flujo o la detección de microscopio de fluorescencia.

Almacenamiento y transporte.

Transporte en hielo mojado; Almacenar a 2-8 ° C en la oscuridad, válida por 12 meses.

Componente:

Número de componentes

Componente

G1514-50t

G1514-100t

G1514-1

Anexoin V-if647

250 μl

2 × 250 μl

G1514-2

Ioduro de propidio (PI)

250 μl

2 × 250 μl

G1514-3

1 × Buffer de unión

25 ml

2 × 25 ml

Manual del usuario del producto

1 PC

Pasos de operación:

1. Células de suspensión: tome la suspensión celular y recoja las células por centrifugación a 500 g durante 5 min a 4 ° C;

Células adherentes: primero recoge el sobrenadante del cultivo celular. Después de la digestión con la tripsina libre de EDTA (G4002 recomendada), combine con el sobrenadante del cultivo celular y recoja las células por centrifugación a 500 g durante 5 minutos a 4 ° C. El tiempo de digestión de tripsina no debe ser demasiado largo, a fin de evitar la digestión excesiva y causar falsos positivos.

2. Lave las células dos veces con PBS previamente enfriado (G4202 recomendado) y recoja las células por centrifugación a 500 g cada vez durante 5 minutos a 4 ° C;

3. Resuspenda suavemente las células en el tampón de unión 1 × pre-enfriado y ajuste la concentración de la celda a 1 ~ 5 × 106 / ml;

4. Tomar 100 μl de suspensión celular, agregue 5 μl de anexina V-if647 y 5 μl PI, mezcle suavemente y proteja de la luz a temperatura ambiente durante 8-10 min;

5. Agregue 400 μl de tampón de unión 1 × pre-enfriado, agite suavemente y realice la detección con un citómetro de flujo o un microscopio de fluorescencia dentro de 1 h.

Análisis de resultados

1. Citometría de flujo

un. Seleccione el voltaje apropiado y ajuste la compensación de la luz durante la detección y el análisis de citometría de flujo. Se recomienda configurar un control negativo (sin ningún marcador) para ajustar la tensión y el control de la etiqueta única (solo se agregan anexina V-if647 y anexina V-if647), excepto para el grupo experimental. Solo agregue PI) para ajuste y compensación;

B. Ejemplos de referencia para detección y análisis de citometría de flujo:

Las células de linfoma de Jurkat T se indujeron con 5 μM de camtotecina durante 6 h. Consulte el procedimiento experimental anterior y use la citometría de flujo para detectar los resultados. Los resultados se muestran en la siguiente figura.

La longitud de onda de excitación máxima de IF647 es de 656 nm y la longitud de onda de emisión máxima es de 670 nm; La longitud de onda de excitación máxima del complejo PI-ADN es de 535 nm y la longitud de onda de emisión máxima es de 615 nm. El diagrama de punto de dispersión se dibuja por el software de análisis relevante del citómetro de flujo, y el IF647 está en la abscisa y la PI está en la ordenada. En un experimento típico, las células vivas no tienen fluorescencia, y los puntos dispersos están en el primer cuadrante de la parte inferior izquierda. Las células apoptóticas en la etapa temprana tienen una fuerte fluorescencia rosada, y los puntos dispersos se encuentran en el segundo cuadrante de la parte inferior derecha. Las células apoptóticas tardías y las células necróticas presentan fluorescencia doble rosa y roja, y los puntos dispersos se encuentran en el tercer cuadrante de la parte superior derecha.

2. Inspección de microscopio de fluorescencia.

Agregue 6 μl de anexina V-if647 y PI Suspensión de células de doble manchada en el deslizamiento de vidrio, cuélgalo con un vidrio de cubierta, y observe debajo de un microscopio de fluorescencia con un filtro de dos colores. La anexina V-if647 tiene una señal de fluorescencia rosa y PI es una señal de fluorescencia roja.

Notas:

1. Durante todo el experimento, la operación debe ser lo más suave posible para evitar la rotura celular y afectar los resultados experimentales.

2. Lavar las células con PBS no se puede omitir, y al mismo tiempo, retire los PBS residuales tanto como sea posible.

3. Cuando utilice la tripsina para digerir las células, debe tener cuidado de evitar daños artificiales a las células y controlar el tiempo de digestión. Si el tiempo de digestión es demasiado corto, las células deben ser sopladas para caerse, lo que es probable que cause daños mecánicos en la membrana celular; Si el tiempo de digestión es demasiado largo, la membrana celular también es vulnerable al daño. Afecta los resultados de las pruebas. Además, no se puede utilizar pancreatina que contiene EDTA. EDTA afectará la unión de la anexina V y Ps.

4. Después de que las células adherentes se estimulan por apoptosis, si algunas de las células flotan, es necesario recolectar el sobrenadante del cultivo celular y las células adherentes y las manchan al mismo tiempo, lo que hará que los resultados sean más precisos.

5. Anexoin V-if647 y PI son sensibles a la luz, evite la luz durante la operación. La prueba debe llevarse a cabo lo antes posible después de la reacción.

6. Por favor, use ropa de laboratorio y guantes desechables durante el experimento para evitar la contaminación y garantizar la seguridad.

¡Este producto es solo para fines de investigación científica, no para el diagnóstico clínico!

G1514-50TB

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