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Kit de detección de apoptosis de células de tono rojo TMR para la sección de parafina Sección de tejido congelado Celular Cell Spear

Volumen: 50t

Estado de Disponibilidad:
  • G1502-50T
  • Servicebio
  • Servicebio

Descripción del producto

Información del Producto:

Nombre del producto

Gato. No.

Volumen

Kit de detección de apoptosis de celda de tono TMR (rojo)

G1502-50T

50t

G1502-100T

100T

Descripción del Producto:

La rotura del ADN cromosómico en apoptosis es un proceso gradual. El ADN cromosómico se degrada primero en grandes fragmentos de 50-300 kB bajo la acción de las nucleasas endógenas, y luego aproximadamente el 30% del ADN cromosómico está bajo la acción de las endonucleasas de CA2 + y MG2 + -pendentales. Se cortan al azar para formar un polímero de ADN nucleosómico de 180-200 pb. Por lo tanto, en la etapa tardía de la apoptosis, el ADN se degradará en fragmentos de 180-200 pb, y se expondrá un gran número de extremos 3'-OH en el ADN genómico roto. Terminal Deoxynucleotidyl Transferasa (TDT) es una polimerasa de ADN independiente de la plantilla que puede catalizar la unión de desoxinucleótidos a los extremos 3'-OH de las moléculas de ADN rotas. Por lo tanto, el kit de detección de apoptosis de células TUNEL (TDT mediada por Dutp Dutp Nick) se puede usar para detectar la rotura del ADN nuclear de las células de tejido en la etapa tardía de la apoptosis. El principio es que, en la acción de la enzima TDT, tetrametil-rodamina-dutp (tetrametil-rodamina-5-dutp, TMR-5-DUTP), se incorpora en el extremo 3'-OH expuesto cuando se rompe el ADN genómico, por lo que Se puede detectar con un microscopio de fluorescencia o citómetro de flujo (excitación de TMR 520-560 nm, emisión 570-620 nm). Este kit tiene una amplia gama de aplicaciones y es adecuado para la detección de apoptosis celulares en secciones de tejido parafina, secciones de tejido congelado, diapositivas de células, frotis de células, etc.

Almacenamiento y transporte.

Bolso de hielo (hielo húmedo) Transporte;

Este kit se almacena a -20 ° C. La mezcla de etiquetado TMR-5-DUTP debe almacenarse a -20 ° C en la oscuridad. El período de validez es de 12 meses.

Componente:

Número de componentes

Componente

G1502-50T

G1502-100T

G1502-1

Enzima TDT recombinante

50 μl

2 × 50 μl

G1502-2

Mezcla de etiquetado TMR-5-DUTP

250 μl

2 × 250 μl

G1502-3

Amortiguador de equilibrio

5 × 1 ml

10 × 1 ml

G1502-4

Proteinasa k (200 μg / ml)

1 ml

2 × 1 ml

Manual del usuario del producto

1 PC

Preparación antes del experimento:

1. Se recomienda el tampón de fosfato PBS (G0002 o G4202);

2. Solución de fijación: 4% Paraformaldehído disuelto en PBS u otro sistema de búfer, pH 7,4 (G1101 se recomienda);

3. Solución de rotura de membrana: 0.1% triton x-100 disuelto en citrato de sodio al 0,1% (G1204);

4. Prepare PBS que contiene 0.2% Triton X-100; Prepare PBS que contiene 0.1% Triton X-100 y 5 mg / ml BSA;

5. Para la tinción del núcleo, debe traer su propio DAPI (2 μg / ml) o PI (1 μg / ml) (G1012, G1021);

6. Si necesita un experimento de control positivo, debe traer su propio DASase I (G3342)

7. Si usa un citómetro de flujo, prepare su propia mancha PI (G1021 recomendada) y RNase A (DNase libre) (G3413 recomendado);

8. Por favor, use la capa de laboratorio y los guantes desechables durante la operación.

Pasos de operación:

I. PREPARACIÓN DE MUESTRA

A. Secciones de tejido incrustado parafina

1. Remoje la sección de tejido de parafina en xileno a temperatura ambiente durante 5-10 min, repita 2-3 veces; Luego, remoje en etanol absoluto durante 5 minutos, repita dos veces; Finalmente, use el etanol degradado (85%, 75%, doble vapor) agua remojada cada vez que una vez, cada vez durante 5 min;

2. Enjuague suavemente la sección con PBS y elimine el exceso de líquido alrededor de la muestra; Use una pluma histoquímica para dibujar un círculo pequeño con una distancia de 2-3 mm del tejido a lo largo del contorno exterior del tejido para facilitar el procesamiento de permeabilidad en la permeabilidad y las operaciones de marcado de equilibrio; Durante el experimento, no deje que la muestra se seque, y coloque la muestra procesada en una caja húmeda para mantener la muestra húmeda;

3. Prepare la solución de trabajo de proteinasa K: proteinasa diluida K (200 μg / ml) Solución de stock con PBS como diluyente en una proporción de 1: 9 para realizar la concentración final de 20 μg / ml;

4. Agregue 100 μl de la solución de trabajo de proteinasa K mencionada anteriormente a cada muestra para que todo se cubra, y se incube a 37 ° C durante 20 min;

(Nota: el tratamiento de la proteinasa K es útil para la permeación de reactivos de tinción en los pasos subsiguientes de los tejidos y las células. El tiempo de incubación demasiado largo o corto afectará la eficiencia de etiquetado posterior. Para obtener mejores resultados, el tiempo de incubación de la proteinasa K se puede optimizar)

5. Infiltrarse y limpiar la muestra con la solución PBS 3 veces, 5 minutos cada vez (la proteinasa K debe lavarse limpia, de lo contrario, interferirá con la reacción de etiquetado posterior) y coloque la muestra procesada en una caja húmeda para mantener la muestra húmedo;

6. (Paso opcional) Retire el exceso de líquido en la muestra, agregue una cantidad apropiada de fluido de ruptura (tritón X-100 al 0,1% en citrato de sodio al 0,1%) al tejido, infiltrado completamente el tejido y tráelo a temperatura ambiente para 20 minutos; Después de que se completa el tratamiento de la ruptura, la muestra se enjuaga con la solución PBS 3 veces durante 5 minutos cada vez; La muestra tratada se coloca en una caja húmeda para mantener la muestra húmeda.

B. Sección congelada del tejido

1. sumerja las diapositivas en una solución de paraformaldehído del 4% (disuelta en PBS) para la fijación, y la incuba durante 10-15 minutos a temperatura ambiente;

2. Después de que la película se extraiga del fijador, déjelo secar naturalmente en una campana de humo;

3. Enjuague las diapositivas en agua pura o PBS para eliminar la solución fijadora restante en las diapositivas;

4. Use un bolígrafo histoquímico para dibujar un pequeño círculo de 2-3 mm, aparte del tejido a lo largo de la periferia del tejido para facilitar el procesamiento de permeabilidad y las operaciones de calificación de equilibrio de la permeabilidad. Durante el experimento, no deje que la muestra seque, y la muestra procesada mantenga la muestra húmeda en una caja húmeda;

5. Prepare la solución de trabajo de proteinasa K: proteinasa diluida K (200 μg / ml) Solución de stock con PBS como diluyente en una proporción de 1: 9 para realizar la concentración final de 20 μg / ml;

6. Agregue 100 μl de la solución de trabajo de la proteinasa K mencionada anteriormente a la muestra para que esté completamente cubierta, y se incube a temperatura ambiente durante 10 min;

(Nota: el tratamiento de la proteinasa K ayuda principalmente a los tejidos y células a impregnar los reactivos de la tinción en los pasos subsiguientes. Si el tiempo de incubación es demasiado largo o demasiado corto, afectará la posterior eficiencia de etiquetado. Si no se obtienen mejores resultados, la incubación El tiempo de proteinasa K puede necesitar ser optimizado)

7. Enjuague la muestra 2-3 veces con la solución PBS para eliminar el exceso de líquido (la proteinasa K debe lavarse limpia, de lo contrario, interferirá con la reacción de etiquetado posterior), y coloque la muestra procesada en una caja húmeda para mantener la muestra húmeda. ;

8. (Paso opcional) Agregue una cantidad adecuada de solución de ruptura (0,1% triton X-100 disuelto en citrato de sodio al 0,1%) al tejido, infiltrado completamente al tejido, y tráelo a temperatura ambiente durante 20 minutos. Lo mismo es cierto después de que se complete el tratamiento de la ruptura. Enjuague la muestra con la solución PBS para eliminar el exceso de líquido, y coloque la muestra procesada en una caja húmeda para mantener la muestra húmeda.

C. Película de escalada celular

1. Cultive las células adherentes en las diapositivas de la cámara Lab-Tek. Después del tratamiento de inducción de la apoptosis, enjuague suavemente las diapositivas dos veces con PBS;

2. Agregue una cantidad apropiada de solución de paraformaldehído al 4% (disuelta en PBS) a cada cámara de deslizamiento para la fijación, y incube durante 20 minutos a temperatura ambiente;

3. Retire el fijador, agregue PBS y se lave 3 veces, 5 min cada vez;

4. Cada muestra se sumerge en una solución de tritón X-100 al 0,2% preparada en PBS, y se incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente para la permeabilidad;

5. sumerja y limpie la muestra 2-3 veces en un vaso abierto lleno de solución PBS;

6. Retire suavemente el exceso de líquido, y se desplace cuidadosamente el líquido alrededor de la muestra en la diapositiva con papel de filtro. La muestra procesada se coloca en una caja húmeda para mantener la muestra húmeda.

D. frotis celular

1. Resuspender las células en PBS a una concentración de aproximadamente 2 × 107 células / ml, pipeta 50-100 μl de suspensión celular sobre el deslizamiento de vidrio anti-gota, y use un deslizamiento de vidrio limpio para propagar suavemente la suspensión celular;

2. sumerja las diapositivas en un frasco de tinción que contiene un 4% de paraformaldehído recién preparado en PBS, fije las células y colóquelas a 4 ° C durante 25 min;

3. sumerja la diapositiva en PBS, déjela a temperatura ambiente durante 5 minutos, y luego repita una vez;

4. Retire suavemente el exceso de líquido, y transpare cuidadosamente el exceso de líquido alrededor de la muestra en la diapositiva con papel de filtro. Use un bolígrafo histoquímico para dibujar un círculo pequeño a lo largo de la periferia de la célula para facilitar el procesamiento de permeabilidad en la permeabilidad y las operaciones de marcado de balance. Durante el experimento, no deje que la muestra se seque;

5. Cada muestra se sumerge en una solución de tritón X-100 al 0,2% preparada en PBS, y se incuba a temperatura ambiente durante 5 minutos para la permeabilidad;

6. Sumerja y limpie la muestra 2-3 veces en un vaso abierto lleno de solución PBS;

6. Retire suavemente el exceso de líquido y use papel de filtro para absorber cuidadosamente el líquido alrededor de la muestra en la diapositiva. La muestra procesada se coloca en una caja húmeda para mantener la muestra húmeda.

II. TRATAMIENTO DE CONTROL DE TRATAMIENTO DE DNASE I (paso opcional)

Después de que la muestra está permeable, trate la muestra con DNase I (G3342 recomendada) para preparar un control positivo.

1. Agregue 100 μl 1 × DRESASE I BUFFER (MÉTODO DE PREPARACIÓN: Tome 10 μl 10 × Tampón DNase I, luego agregue 90 μL de agua desionizada para mezclar) gota a gota a la muestra impregnada, e incubar a temperatura ambiente durante 5 min;

2. Retire suavemente el exceso de líquido y agregue 100 μl de solución de trabajo que contiene DNase I (20 U / ml) (Método de preparación: tome 10 μl 10 × DNase i BURCHER, luego agregue 2 μL de DDNase I, y luego agregue 88 μl de mezcla de agua desionizada ), incube a temperatura ambiente durante 10 min;

3. Retire suavemente el exceso de líquido, y lave las diapositivas 3-4 veces en un frasco de tinción lleno de PBS.

(Nota: se debe usar un tanque de tinción separado para las diapositivas de control positivo, de lo contrario, la DNasa residual I en las diapositivas de control positivo puede introducir un fondo alto en las diapositivas experimentales)

III. Marcado y Pruebas

1. Equilibración: agregue 50 μl de tampón de equilibrio a cada muestra para cubrir el área de la muestra a probar, e incubar a temperatura ambiente durante 10 min;

2. Preparación de la solución de etiquetado: THAW TMR-5-DUTP Etiquetado de la mezcla y el amortiguador de equilibrio en hielo, y siga la enzima TDT recombinante: la mezcla de etiquetado TMR-5-DUTP: tampón de equilibrio = 1 μl: 5 μl: 50 μl (1: 5 : 50) Mezcle el tampón de incubación TDT que sea suficiente para todos los experimentos. El volumen de reactivos utilizado en experimentos específicos se puede ajustar en una proporción apropiada de acuerdo con el tamaño de la diapositiva;

3. Sistema de control negativo: prepare un tampón de incubación de TDT de control sin enzima TDT recombinante y reemplácelo con DDH2O;

4. Etiquetado: intente eliminar el búfer de equilibrio equilibrado y luego agregue 56 μl de tampón de incubación TDT a cada muestra de tejido, e incube a 37 ° C durante 1 h; Tenga cuidado de no secar las diapositivas, y las diapositivas deben protegerse de la luz;

5. Enjuague inmediatamente la muestra del tejido con PBS durante 4 veces, 5 minutos cada vez;

6. Limpie suavemente la solución PBS alrededor de la muestra con papel de filtro;

7. Tinción nuclear: la muestra se mancha en el tanque de tinción, y la diapositiva se sumerge en el tanque de tinción que contiene una solución DAPI (recién preparada y diluida con PBS) en la oscuridad, y se deja a temperatura ambiente durante 8 minutos;

8. Montaje de la diapositiva: después de la muestra, lava la muestra del tejido 3 veces con PBS durante 5 minutos cada vez, luego retire suavemente el exceso de líquido, y agregue tabletas de montaje de anillo antifleorescencia a gota (recomendado G1401) para montar la diapositiva ;

7. Examen microscópico: analice la muestra inmediatamente bajo un microscopio de fluorescencia. La diapositiva debe estar protegida de la luz. DAPI puede manchar las células apoptóticas y no apoptóticas azules, y TMR-5- solo está presente en el núcleo apoptótico. Fluorescencia roja localizada por la incorporación de DUTP.

IV. Use citometría de flujo para detectar celdas de suspensión.

1. Lave las células a probarse dos veces con PBS, centrifugar a 4 ° C (500 g) y resuspender en 500 μl de PBS;

2. Fijación: agregue 5 ml de solución de paraformaldehído al 1% preparada con PBS a la muestra, fije las celdas y coloque sobre hielo durante 20 minutos;

3. Centrifuge las células a 300 g durante 10 minutos a 4 ° C, retire el sobrenadante y resuspéndolos dos veces en 5 ml de PBS, y finalmente resuspenda las células en 500 μl de PBS;

4. Permeabilización: agregue 5 ml de etanol al 70% previamente enfriado en hielo a la muestra e incube a -20 ° C durante 4 horas para impregnar las células;

(Nota: las células también se pueden permeabilizar con triton X-100 al 0,2% en la solución PBS a temperatura ambiente durante 5 minutos)

5. Después de la centrifugación a 300 g durante 10 min, las células se resuspendieron en 5 ml de PBS, y se resuspendieron en 1 ml PBS después de la centrifugación;

6. Equilibración: transferir aproximadamente 2 × 106 células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, centrífugo a 300 g durante 10 min, retire el sobrenadante y se resuspenda en un tampón de equilibrio de 80 μl, e incube a temperatura ambiente durante 5 min;

7. Preparación de la solución de etiquetado: THAW TMR-5-DUTP Etiquetado de etiquetado y tampón de equilibrio en hielo, y siga la enzima TDT recombinante: mezcla de etiquetado TMR-5-DUTP: tampón de equilibrio = 1 μl: 5 μl: 50 μl (1: 5 : 50) Mezcle el tampón de incubación TDT que sea suficiente para todos los experimentos y reacciones opcionales de control positivo;

8. Etiquetado: las células se centrifugaron a 300 g durante 10 min, se eliminó el sobrenadante y el pellet se resuspendió en un tampón de incubación TDT de 56 μl, y se incubó a 37 ° C durante 1 h, protegido de la luz. Resuspenda suavemente las células con una micropipeta cada 15 minutos;

9. Una vez finalizada la reacción, agregue 1 ml de EDTA de 20 mm para detener la reacción, y mezcle suavemente con una micropipeta;

10. Centrifugue a 300 g durante 10 minutos, retire el sobrenadante y resuspenda el sedimento en 1 ml de solución de tritón X-100 al 0,1% preparada con PBS, que contiene 5 mg / ml BSA, y se lava dos veces;

11. Tinción nuclear: centrifugue a 300 g durante 10 min, retire el sobrenadante y resuspenda el sedimento de células en una solución DAPI de 0,5 ml que contiene 250 μg de RNasa libre de DNasa A. Incube las células durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad;

12. Detección a bordo: análisis de citometría de flujo de células, DAPI puede manchar los núcleos apoptóticos y no apoptóticos en azul, y solo en los núcleos apoptóticos pueden haber una incorporación TMR-5-DUTP y la fluorescencia roja localizada.

V. Diagrama de Proceso Experimental

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Atención:

¡Este producto es solo para fines de investigación científica, no para el diagnóstico clínico!

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