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Kit de detección de proliferación de células EDU-594 Click-IT

Volumen: 100t

Estado de Disponibilidad:
  • G1603
  • Servicebio

Descripción del producto

Introducción del producto:

Es un método de evaluación común e importante en las ciencias de la vida para determinar la influencia de ciertos genes, fármacos, etc. en las células cultivadas in vitro al analizar la capacidad de proliferación celular, o analizar la capacidad de crecimiento y renovación de las células de tejido individuales en diferentes Condiciones o intervenciones de estimulación. . Hay muchos métodos para detectar la proliferación celular. La mayoría de ellos utilizan algunas enzimas metabólicas producidas por las células para evaluar indirectamente la actividad de proliferación de las células (como el método CCK-8, el método MTT, etc.), pero algunos medicamentos o factores, como el estado de la celda, tendrán un cierto. Impacto en los resultados de la evaluación. La detección directa de la síntesis de ADN en las células para determinar la proliferación celular se reconoce como el método de detección más preciso y efectivo. Sin embargo, tanto el método original de incorporación de nucleósidos radiomípelos como la mejora posterior del método BRDU basado en la detección de anticuerpos tienen sus propias limitaciones.

Edu (5-ethynyl-2'-desoxiuridina, 5-etynyl-2'-desoxiuridina) es un análogo de timidina que contiene un grupo de acetileno, cuando se inyecta en animales o en células incubadoras cultivadas in vitro, estas pequeñas moléculas pueden difundirse rápidamente a varios órganos y Los tejidos, y se infiltran en las células, y pueden reemplazar la timidina (t) en el ADN recién sintetizado durante la proliferación celular. El grupo de acetileno en la molécula de EDU puede reaccionar con la sonda compuesta de azida con fluorescencia etiquetada para formar un anillo de triazol estable en la catálisis de iones de cobre, por lo que el ADN recién sintetizado se puede etiquetar con la sonda fluorescente correspondiente. En comparación con el método de incorporación de nucleósidos radiolabulados, el método de detección de EDU no tiene factores limitantes, como la contaminación radiactiva; En comparación con el método de detección de Brdu, el método de detección de EDU no requiere tratamiento de desnaturalización de ADN o reacción de antígeno-anticuerpo, lo que reduce en gran medida la complejidad del experimento y el tiempo, también se convierte en más tiempo de ahorro de tiempo, más sensible, más estable y más preciso. . Este kit se puede usar para detectar la proliferación celular en células cultivadas o tejidos animales in vitro. La sonda fluorescente en este kit es la fluorescencia roja, la longitud de onda de excitación máxima es de 593 nm, y la longitud de onda de emisión máxima es de 614 nm. Después de que las células de proliferación estén etiquetadas, el núcleo celular mostrará la fluorescencia roja brillante. El núcleo celular se etiqueta conjuntamente con el tinte nuclear convencional coincidente (este kit proporciona un tinte nuclear de Hoechst 33342, puede usar el microscopio de fluorescencia, el microscopio confocal con láser y otros instrumentos para observar directamente la proliferación celular; También puede usar la citometría de flujo para detectar la intensidad de fluorescencia de las células cultivadas in vitro, y juzgar el ciclo celular basado en la actividad de replicación de ADN de intensidad de fluorescencia en la fase media.

Almacenamiento y transporte.

Transportado en hielo húmedo; almacenado a -20 ° C en la oscuridad, el reactivo catalítico de EDU (reactivo a) y el tampón de reacción se pueden almacenar a 4 ° C; Válido por 12 meses.

Número de componentes

Componente

G1603-100t

G1603-1

Solución de almacenamiento EDU (10 mm)

100 μl

G1603-2

Reactivo catalítico (reactivo a)

120 μl

G1603-3

Dye fluorescente IF488 (Reactivo B)

50 μl

G1603-4

Aditivos catalíticos (reactivo c)

2 × 100 mg (polvo)

G1603-5

Tampón de reacción

20 ml

G1603-6

Hoechst 33342 Solución de tinción

30 μl

Manual del usuario del producto

1 PC

Nota: Los tiempos de reacción anteriores corresponden a la detección de placas de 96 pocillos.

Preparación de experimentos

1. Medio de cultivo celular que contiene suero;

2. Solución de permeabilidad: solución de tampón que contiene 0.2-0.5% Triton X-100 (G1204 se recomienda);

3. Solución de fijación: 4% paraformaldehyde (G1101 recomendado) u otros reactivos para fines similares;

4. El búfer PBS (G4202 se recomienda);

5. Agua ultra pura;

6. Modelado animal y reactivos relacionados con la sección de tejidos (detección de proliferación celular de tejido animal).

Pasos de operación:

1. Preparación de muestras de células in vitro y reactivos:

1.1. Plante las células uniformemente en la placa de cultivo celular a una determinada densidad (la densidad de plantación se determina por factores tales como el tamaño celular, la velocidad de crecimiento, etc.). Después de que las celdas se adhieran a la pared o regresen a un estado normal, realice la estimulación de fármaco correspondiente y otros tratamientos (como las células de suspensión de prueba, siga el método de operación normal de las células de suspensión, todo el experimento debe agregar pasos como la centrifugación).

1.2. Centrifugar el aditivo catalítico (reactivo C) a baja velocidad, agregue 1 ml de agua ultrapure para disolverlo, y almacenarla a -20 ℃ para su uso posterior.

2. Etiquetado EDU, fijación y permeabilización de células in vitro:

2.1. Prepare 2 × Solución de trabajo de la incubación de EDU: agregue 2 μl de solución de almacenamiento EDU (10 mm) a cada 1 ml de medio de cultivo celular completo, que es de 20 μm 2 × Solución de trabajo de incubación de EDU, y colóquela en la incubadora para precalentar (es recomendó que el pre-experimento se explore con la concentración de trabajo de EDU de 10 μm);

2.2. En el modo de medio cambiante, la mitad de aspiración del medio de cultivo celular original en la placa de cultivo, y agrega un volumen igual de solución de trabajo de incubación de 2 × edu precalentada, e incube durante un cierto período de tiempo (el tiempo de incubación generalmente depende En el crecimiento celular correspondiente, el ciclo generalmente representa aproximadamente el 10% del tiempo del ciclo celular. Para las células más adherentes y de rápido crecimiento, se recomienda incubar durante aproximadamente 2 horas. Para condiciones específicas, debe ajustarse de acuerdo con el Características celulares y condiciones reales después del tratamiento. Si se requiere una incubación más larga, el tiempo puede reducir adecuadamente la concentración de trabajo de EDU; por un tiempo más corto, la concentración de EDU puede aumentar adecuadamente);

2.3. Después de que la muestra de celda etiquetada con EDU se lava con un tampón PBS durante 1-2 veces, agregue la solución fijadora para cubrir las celdas y solucionar a temperatura ambiente durante 15 minutos (si se requiere la detección de flujo, se adhieren a las celdas antes de este paso. digestión y resuspensión, solucionarlo y luego seguir el método de procesamiento de células de suspensión); Lave 2-3 veces con tampón PBS, cada vez durante 3-5 min;

2.4. Retire el búfer PBS, agregue permeado para cubrir las celdas o tejidos, e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos;

2.5. Después de eliminar el permeado, lave 1-2 veces con un tampón PBS durante 3-5 minutos cada vez, y luego vaya al paso 4.

3. EDU EDU Modelado de inyección y procesamiento de la sección de tejidos:

3.1. De acuerdo con los requisitos experimentales, una o más inyecciones de EDU se utilizan para modelar animales por inyección intraperitoneal, inyección intramuscular, inyección subcutánea, inyección de vena de cola, etc. En general, la relación de la dosis de EDU al peso corporal animal es de 5 mg / kg. Inyección específica La cantidad depende del contenido de investigación y las condiciones de los animales. Parte de la solución de almacenamiento de EDU se proporciona en este kit, que se utiliza principalmente para el etiquetado de EDU de células in vitro. Si necesita modelar animales con EDU, puede solicitar el reactivo de EDU por separado (se recomienda G5059);

3.2. El intestino delgado y otras células de tejido epitelial proliferan rápidamente, y las células de tejido cerebral proliferan lentamente. Los tejidos de crecimiento más rápido generalmente toman menos de 12 horas para marcar, mientras que el tejido más lento puede tardar varios días en marcar; El mejor tiempo de marcado se basa en dependiendo del experimento específico, ya que el tejido epitelial intestinal pequeño se prolifera rápidamente, se recomienda usar este tipo de tejido como una referencia de etiqueta;

3.3. Después de que los animales modelados se someten a muerte de acuerdo con las normas prescritas, se eliminan los tejidos requeridos, y las secciones congeladas o las secciones de parafina se realizan de acuerdo con los procedimientos convencionales;

un. Para las secciones congeladas: volver a la temperatura ambiente, agregue una cantidad apropiada de fijación y fije a temperatura ambiente durante 15 minutos. Retire el fijador y lave 3 veces con una cantidad apropiada de tampón PBS durante 3-5 minutos cada uno; Retire el búfer PBS y cubra el tejido con una cantidad adecuada de solución de permeabilidad e incube a temperatura ambiente durante 10-15 min; Retire la solución de permeabilidad y se lava 1 con el tampón PBS -2 veces, 3-5 minutos cada vez, luego vaya al paso 4.

B. Para las secciones de parafina: depadofiniza y rehidrata las secciones y se lava con PBS durante 5 min. Retire el tampón PBS, agregue permeado para cubrir las celdas o tejidos, e incubar a temperatura ambiente durante 15 min; Después de eliminar el permeado, lave 1-2 veces con un tampón PBS durante 3-5 minutos cada vez, y luego vaya al paso 4.

4. EDU Haga clic en Respuesta:

4.1. Durante la fijación celular o del tejido y la perforación, prepare la solución de reacción de clic (para diferentes sistemas de preparación de muestras, consulte el esquema en la tabla a continuación)

Para las células cultivadas in vitro: este paso de referencia corresponde al volumen y la dosis de 10 muestras de placa de 96 pocillos (100 μl por pocillo). La cantidad de preparación se puede aumentar o disminuir en proporción a los requisitos de uso. Agregue los componentes en el orden que se muestra en la tabla a continuación. Agregar lado y mezclar bien (preparado y utilizado ahora);

Componente

Volumen

Tampón de reacción

935 μl

Reactivo catalítico (reactivo a)

10 μl

DYE fluorescente IF594 (Reactivo B)

5 μl

Aditivos catalíticos (reactivo c)

50 μl

Capacidad total

1000 μl

Para las rodajas de células de tejido: consulte el siguiente sistema para la preparación del sistema de solución de reacción de clic. La cantidad de preparación se puede aumentar o reducir en proporción al número de muestras de corte. Cada muestra de rebanada está cubierta con aproximadamente 100-200 μl de solución de reacción de clic.

Componente

Volumen

Tampón de reacción

928 μl

Reactivo catalítico (reactivo a)

10 μl

DYE fluorescente IF594 (Reactivo B)

12 μl

Aditivos catalíticos (reactivo c)

50 μl

Capacidad total

1000 μl

4.2. Retire el búfer PBS de la etapa anterior (paso 2.5 o 3.3), agregue la solución de reacción de clic, agite suavemente para asegurarse de que la solución de reacción cubra todas las celdas o tejidos, e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad;

4.3. Retire la solución de reacción de clic y lave 2-3 veces con tampón PBS durante 3-5 minutos cada vez (si no hay otros requisitos especiales, puede usar la citometría de flujo para detectar la intensidad de fluorescencia o usar otros instrumentos para detectar el efecto de fluorescencia) .

5. Tinción nuclear:

5.1. Retire el búfer PBS en el paso anterior, diluya la solución de tinción Hoechst 33342 y el tampón PBS en una proporción de 1: 500-1000, agregue las células de cubierta e incube durante 5 min;

5.2. Retire la solución de tinción Hoechst 33342, y lave 2-3 veces con un tampón PBS durante 3-5 minutos cada vez.

6. Análisis de imágenes y detección.

Coloque directamente las células cultivadas o las muestras de corte de tejidos en un microscopio de fluorescencia o un microscopio confocal para analizar la proporción de células proliferantes; O recoge las células cultivadas in vitro y use un citómetro de flujo para detectar la intensidad de la fluorescencia (se recomienda usar una muestra de celda marcada con EDU como un control negativo para la detección de citometría de flujo, y se selecciona el voltaje apropiado). De acuerdo con la intensidad de la fluorescencia, se puede juzgar la actividad de replicación del ADN en la fase S del ciclo celular. Las características espectrales correspondientes del tinte fluorescente IF594 (reactivo B) de este kit son EX / EM: 593 NM / 614 NM (rojo); Las características espectrales correspondientes de la solución de tinción Hoechst 33342 son EX / EM: 346 NM / 460 NM (azul).

Notas:

1. Para las células cultivadas in vitro, la concentración de EDU específica y el tiempo de incubación se pueden ajustar adecuadamente según la muestra y el propósito de la investigación.

2. Algunas células de tejido proliferan lentamente. Para eliminar los factores tales como los efectos de modelado deficientes, se recomienda seleccionar muestras de tejido con proliferación rápida como muestras de referencia (como el tejido intestinal).

3. Si el color de fondo es demasiado oscuro, puede ser causado por un lavado insuficiente en el experimento, el tiempo de fijación de la muestra de tejido demasiado largo y el fijador residual.

4. El reactivo de adición catalítica de EDU (reactivo c) es fácil de oxidar. Trate de evitar la exposición prolongada al aire. Después de prepararse en una solución acuosa, se recomienda almacenar en alícuotas; Después de la prueba, si el color del reactivo de adición catalítico de EDU cambia ligeramente, el sistema Catalítico de reacción de clics sigue siendo el mismo que puede continuar normalmente. Si aparece Brown, indica que el componente ha caducado, así que por favor lo descarte.

5. Por favor, use la capa de laboratorio y los guantes desechables durante la operación.

¡Este producto es solo para fines de investigación científica, no para el diagnóstico clínico!

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