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T4 ADN Ligase 5 U / μL para conexión de la biología molecular de conexión de ADN

Especificación: 500U
Estado de Disponibilidad:
  • G3340-100
  • Servicebio
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Descripción del producto

G3340-100

Introducción:

T4 ADN Ligase puede catalizar la unión de ADN o ARN de doble cadena pegajoso o borroso entre el extremo 5'-P y el extremo 3'-OH con un bono de fosfodiéster. Al mismo tiempo, la enzima también puede reparar las mellas monocatenarias en el ADN de doble cadena, el ARN y las cadenas híbridas de ADN / ARN / ARN.

Definición de actividad: Una unidad de enzima puede catalizar a 1 Nmol de pirofosfato marcado en 32P en ATP a través de la reacción de desplazamiento dentro de 20 minutos a 37 ° C (una unidad es igual a las 200 unidades de fijación adhesivas).

T4 ADN Ligase BUFFER DE ALMACENAMIENTO:20 mm Tris-HCl (pH 7,5), KCL 50 mM, 1 mM DTT, 50% (v / v) glicerol.

5 × T4 DNA Ligase BUFFER:250 mm Tris-HCl (pH 7,6), MGCL de 50 mm2, ATP de 5 mm, DTT de 5 mm, potenciador.

Almacenamiento y transporte.

Transporte con hielo húmedo; Almacenamiento a -20 ° C, válido por 12 meses.

Número de componentes

Componente

G3340-50

G3340-100

G3340-1

T4 ADN Ligase

250 u (50 μl)

500 u (100 μl)

G3340-2

5 × T4 T4 DNA Ligase Buffer

1 ml

2 × 1 ml

Manual de usuario

1

Condiciones de reacción de ligación

La reacción de ligación a 25 ° C para los extremos pegajosos dura 5-30 minutos; La reacción de ligación a 25 ° C para los extremos romos no excede las 2 horas o la reacción a 4 ° C durante la noche.

Conversión de productos de ligación.

1. Saque las células competentes (como E.coli DH5α, E.coli Top10, etc.) desde el refrigerador -80 ℃ y colóquelos en hielo para descongelar;

2. Agregue la muestra reaccionada al estado competente, mueva suavemente la parte inferior del tubo con los dedos para mezclarse, y bañarse en hielo durante 30 minutos;

3. Luego coloque el producto en un baño de agua de 42 ℃ para calentar el choque durante 90 s. Después de que termine, colóquelo en hielo rápidamente durante 2-5 minutos en un baño de hielo;

4. Tome 900 μl de medio SOC o LB estéril y agréguelo al tubo EP. Después de mezclar, coloque el tubo EP en una coctelera e incube a 220 rpm a 37 ° C durante 1 hora para resucitar las bacterias (también se puede colocar en una incubadora de 37 ° C. Coloque el cultivo durante 1 h);

5. De acuerdo con los requisitos experimentales, dibuje diferentes volúmenes de células competentes transformadas y agreguelos al medio sólido LB que contiene los antibióticos correspondientes, propague las células uniformemente, y después de que el líquido se absorbe completamente, coloque la placa boca abajo en el 37 ° C incubadora y cultiva durante la noche.

Identificación de clones positivos.

Las colonias monoclonales cultivadas en la placa se seleccionan para la identificación de la PCR de la colonia, o después de la cultura, el plásmido se extrae mediante la digestión de restricción o la identificación de la PCR, o el plásmido extraído se secuencial y se analiza directamente para la identificación.

Precauciones

1. Se recomienda configurar el sistema de reacción en el hielo.

2. Cuando la concentración del vector y el fragmento objetivo es bajo, no es necesario agregar agua y usarlo directamente para compensar.

3. Se recomienda que la relación molar de ADN vector para insertar el fragmento de ADN sea 1: 3 ~ 1: 10.

4. Una pequeña cantidad de precipitación en el tampón Ligase de ADN de 5 × T4 es normal. Puede disolverse a 37 ° C antes del experimento, y se utilizará después de mezclar a fondo. No tiene efecto en el experimento; Se recomienda disolverse en alícuotas y congelarse para su uso.

5. Se recomienda que T4 ADN Ligase se elimine cuando se usa y vuelva a colocar a -20 ℃ inmediatamente después de su uso.

6. Cuando se utiliza la electroporación para la transformación, el producto de ligación debe ser purificado por método de columna o método de precipitación de etanol.

7. Cuando se conecta el vector de extremo contorno al fragmento de ADN, el vector debe ser desfosforilado (se recomienda G3400) para evitar su autocircularización.

8. Por favor, use la capa de laboratorio y los guantes desechables durante la operación.

G3340-1004G3340-100O

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