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T7 Kit de transcripción de alto rendimiento para la síntesis de ARN

Especificación: 50t
Estado de Disponibilidad:
  • G3021-50t
  • Servicebio
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Descripción del producto

G3021-50t

Introducción del producto

Este kit está utilizando la ARN polimerasa T7 para contener un ADN plasmídico linealizado, un producto de PCR o ADN sintético que contiene un promotor T7, y la síntesis del ARN se transcribe in vitro. Este kit optimiza el sistema de reacción transcripcional de ARN in vitro, que simplemente puede obtener rápidamente un gran número de moléculas de ARN. Si se agrega el nucleótido modificado en el sustrato, se puede preparar el nucleótido reactivo y se puede preparar ARN etiquetado. Este kit se utiliza principalmente en la traducción in vitro, el experimento de protección RNASE, la etiqueta de la sonda híbrida, el corte de ARN y otros experimentos biológicos. Una entrada de plantilla de 1 μg en el sistema de reacción puede producir un ARN superior a 100 μg, adecuado para la preparación del ARN de longitud 100-5000 nt.

Almacenamiento y transporte.

Transporte con hielo mojado; Almacenamiento a -20 ° C, válido por 12 meses.

Pasos

1. Preparación de la plantilla:

un. Use el plásmido del promotor T7 como la plantilla: para obtener ARN de una longitud específica, la plantilla de plásmido debe estar completamente linealizada (debe ser purificada como plantilla), y el plásmido linealizado debe asegurarse de que las hilos dobles sean Termina contundente o 5'Oversa (evita que aparezcan 3'Oversa), la cantidad de plantilla recomendada para cada reacción es de 1 μg;

B. Use el producto PCR del promotor T7 o el fragmento de ADN sintetizado como plantilla: cuando la PCR amplificante la plantilla, agregue el promotor T7 (5'-TAATACGACTCACTATIGGG-3 ') a la 5'end del cebador de cadena no codificante. Los productos de PCR se pueden usar directamente como plantillas de transcripción sin purificación, pero se producirá más ARN después de la purificación. La cantidad de plantilla recomendada para cada reacción es de aproximadamente 0,5 μg.

2. Reacción de transcripción: de acuerdo con el sistema de reacción recomendado en la tabla, agregue varios reactivos al tubo EP limpio, mezcle bien y reaccione a 37 ° C durante 2 horas. (Si la sintetización ARN es inferior a 300 nt, se recomienda extender el tiempo de reacción a 4 h o más).

Componente

Volumen

Modelo

0.5-1 μg

Tampón de reacción de transcripción 5 × T7

4 μl

Mezcla NTP de 25 mm

2 μl

Mezcla de enzimas de transcripción de ARN T7

4 μl

Agua libre de nuclease

A 20 μl

3. Una vez completada la reacción, agregue 1 μL de DNase I al sistema, y ​​reaccionar a 37 ° C durante 15 minutos para digerir la plantilla de ADN transcrita.

4. El ARN sintetizado se puede utilizar en experimentos aguas abajo después del análisis de la electroforesis y la purificación.

5. Cantificación y detección de productos de transcripción: la concentración de ARN se puede determinar mediante un método de absorción ultravioleta (los nucleótidos libres afectarán la precisión de la cuantificación, los productos de ARN deben purificarse); Se recomienda la detección de electroforesis para usar la detección de gel de desnaturalización de agarosa del 1% de formaldehído, la solución de electroforesis es 1 × tampón de mops (10 × tampón de mops: trapeadores de 0,4 m, pH 7,0, acetato de sodio de 0,1 m, EDTA de 10 mm). Método de preparación de gel: pesa 0.5 g de agarosa en 36 ml de agua sin RNasa, calor para fundirse, y agregue 5 ml de 10 × tampón MOPS. Cuando la solución se enfría para no caliente, agregue 9 ml de solución de formaldehído (37%), mezcle bien y vierta el pegamento. Durante la detección de electroforesis, mezcle una cantidad apropiada de ARN con tampón de carga de ARN, incube a 70 ° C durante 10 minutos, luego baño de hielo durante 2 minutos y vea todas las muestras. Después de la electroforesis, mancha con EB o serie (G3606) para su observación.

Precauciones

1. La superficie de la piel humana es rica en RNasa. Por favor, use guantes y máscaras experimentales cuando experimenten. Los consumibles experimentales son estériles y libres de enzimas para evitar la contaminación de RNasa.

2. Si necesita preparar ARN etiquetado, reemplace la mezcla NTP en el kit.

3. La longitud de la transcripción de la plantilla de control en el kit es de 500 nt.

4. Para su seguridad y salud, utilice capas de laboratorio y guantes desechables para la operación.

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